Nat Methods | 杨辉团队等开发出高精度、高活性的单碱基编辑工具

2016年4月20日，David Liu（刘如谦）等人在 Nature 发表论文，在 J. Keith Joung 研究的基础上首次开发出了单碱基编辑器，可将G•C碱基对转换成T•A 碱基对，宣告了基于CRISPR的DNA单碱基编辑技术的正式诞生。

单碱基编辑技术，与CRISPR/Cas9相比，能更加微妙精细的修改DNA。这对于治疗众多的单碱基遗传病来说具有巨大的优势，而且潜在风险也更小。因此单碱基编辑器的出现，给基因编辑领域带来了巨大的惊喜。

但是2019年，单碱基编辑工具的安全性受到了质疑，杨辉团队、高彩霞团队背靠背在 Science 杂志发表论文，首次发现胞嘧啶单碱基编辑系统存在严重脱靶效应（中国团队证实CRISPR单碱基编辑存在严重脱靶效应，医疗应用前景堪忧）

接着J. Keith Joung团队在Nature发表论文，表明单碱基编辑的脱靶效应比想象中还要严重，它不仅会导致DNA突变，还会导致大量RNA突变。（创始人自曝CRISPR单碱基编辑竟会导致大量RNA突变，单碱基编辑的脱靶效应比想象中还要严重）

此后，单碱基编辑奠基人David Liu先后发表多篇论文，改进单碱基编辑系统，降低其对RNA的编辑活性（CRISPR单碱基编辑创始人David Liu升级ABE单碱基编辑器，不再担心意外的RNA编辑活性）

虽然这些研究通过引入突变的方式显著降低了RNA的脱靶，但是胞嘧啶单碱基编辑器的DNA脱靶依然没有得到解决。

2020年5月18日，中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心杨辉研究组、中国科学院上海营养与健康研究所隶属于的计算生物学研究所（中国科学院-马普学会计算生物学研究所）李亦学研究组和中国农业科学院深圳农业基因组研究所左二伟研究组合作，在 Nature Methods 杂志上在线发表了题为：A rationally engineered cytosine base editor retains high on-target activity while reducing both DNA and RNA off-target effects 的研究论文。

该研究根据蛋白结构预测了脱氨酶ssDNA结合的重要氨基酸，在不影响催化活性的情况下，突变相应的氨基酸（APOBEC1上的ssDNA结构域相应氨基酸），从而得到了显著降低DNA脱靶的CBE突变体。

CBE的脱靶是由脱氨酶产生的。脱氨酶利用自身的ssDNA和RNA结合能力，携带Cas9蛋白在基因组或者转录组中随机与ssDNA和RNA结合，并且利用自身催化活性将C突变为T，从而造成单碱基基因编辑工具基因组和转录组范围内完全随机无法预测的脱靶效应。

对此，研究者通过两种方式试图降低CBE的脱靶，第一种是在CBE的脱氨酶APOBEC1上引入突变，以此消除ssDNA和RNA的结合能力。他们一共构建了23个CBE突变体，其中 4个突变体不影响基因编辑效率检测，而后通过DNA和RNA的脱靶检测后获得的3个突变体BE3R126E、BE3R132E和YE1-BE3能够显著降低DNA和RNA的脱靶SNV。该方法是通过突变APOBEC1上的核酸结合域关键位点，改变蛋白构象，破坏结合能力，降低随机脱靶。

另一种是利用来自于人的APOBEC3A蛋白替换APOBEC1蛋白，并在APOBEC3A的ssDNA结合位点引入突变，但是这种方式只能降低RNA的脱靶，而不能降低DNA上的脱靶。因此，本研究即以YE1-BE3为研究重点。为了进一步提高YE1-BE3编辑效率，研究者随后又在突变体基础上增加标签和核定位序列（FNLS）。

优化后的单碱基编辑工具YE1-BE3-FNLS，在保证高保真的情况下，显著提高了基因编辑效率，从而成为既安全又高效的新的基因编辑工具。

该研究结果和 David Liu 团队今年2月10日发表在 Nature Biotechnology 的研究结论一致（David Liu再出手，背靠背两篇NBT论文，再次升级CRISPR基因编辑系统）

两篇文章都报道YE1在保持较高的编辑效率的同时降低了DNA和RNA上的脱靶，并且同时缩小了编辑窗口并降低了indel产生的比例。

但是 David Liu 团队基于细菌抗性筛选的方法只适用于CBE，而杨辉团队基于GOTI的方法是不受限制的，不仅可以检测单碱基编辑器，还可以用于其它基于融合蛋白的基因编辑工具的安全性检测和改进。

在本研究中杨辉团队使用GOTI和RNA-Seq同时检测了突变体的DNA脱靶和RNA脱靶，并且发现DNA和RNA的脱靶是互相独立的，需要同时检测。他们获得的YE1-BE3-FNLS是高精度、高活性单碱基编辑工具，显著降低了脱靶效应和提高了编辑效率，有望应用于遗传疾病基因治疗，推动基因编辑临床化应用。

据悉，该项工作由中国农业科学院深圳农业基因组研究所左二伟研究员，中科院分子细胞卓越创新中心孙怡迪博士，中国农业科学院深圳农业基因组研究所助理研究员袁堂龙，中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心贺冰冰和周昌阳博士等，在神经所杨辉研究员, 马普计算生物学研究所李亦学研究员和中国农业科学院深圳农业基因组研究所左二伟研究员指导下完成。

Nat Methods | 杨辉团队等开发出高精度、高活性的单碱基编辑工具

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