【细胞治疗原创文章】不同病毒载体之上游工艺差异

近期,国内细胞治疗市场好消息不断,继复星凯特CAR-T治疗产品阿基仑赛注射液获批上市后,药明巨诺申报的CAR-T治疗产品瑞基仑赛注射液也更新为“待审批”状态。两个消息均不同程度的振奋了国内细胞治疗市场,同时,也吹起了国内细胞治疗企业同行们前进的号角。


      在细胞治疗产品生产过程中,病毒载体一直是非常关键的原材料。目前,市场主流的病毒载体可以分为两种病毒载体,即γ-逆转录病毒载体和基于HIV-1改造得到的慢病毒载体。上述两个CAR-T细胞产品所选择的病毒载体分别是逆转录病毒载体和慢病毒载体。两种病毒载体的生产工艺存在较大差异,选择何种病毒载体及其病毒载体的生产方式,将直接影响CAR-T产品的成本和盈利。


       目前,上述两种病毒载体在病毒载体上游工艺上的差异主要在于病毒载体包装方式和细胞培养方式。


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病毒载体包装方式的差异

       在已经商业化的产品中,慢病毒载体包装方式基本采用瞬时转染生产的方法。经过数十年的发展,已由两质粒瞬转包装方式进化至更加安全的四质粒共转染方式进行病毒载体包装。



       在这个过程中,受到质粒总量、质粒间比例、转染试剂、细胞状态等的影响,病毒载体滴度存在较大的不确定性。有文献报道,不同的包装条件下,病毒载体产量可以在0.2×106~2×107TU/ml之间波动 (Schweizer& Merten,2010)。并且,随着包装质粒数量的增加,病毒载体上游工艺的复杂程度也相应增加了,需要采用更多的控制手段对病毒载体包装用的质粒和包装后的病毒载体进行生产控制和质量控制,间接增加了生产成本。


       在已经商业化的产品中,逆转录病毒载体包装方式基本采用稳定表达生产的方法。通常采用基因工程的方法将目的基因(geneofinteresting,GOI)转入生产用细胞,经过单克隆筛选获得稳定表达目的病毒载体的高产细胞株。目前常用的生产用细胞基质有PG13细胞(NIH3T3来源)、293GP-A2细胞(HEK293SF来源)、CatPac(HEK293来源)等多种细胞(Parket al.,2018)。采用此种方式生产的逆转录病毒载体,在生产过程中可以省略GMP级质粒的生产步骤、质粒放行检测、质粒共转染步骤。同时,由于生产过程中不使用质粒,下游纯化去除质粒DNA和病毒载体产品放行时检测质粒残留的压力将会消失,有助于提高病毒载体的产品质量。正是基于上述优势,逆转录病毒载体具有产量稳定、生产成本低廉的优势。


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细胞培养方式的差异

      在商业化细胞治疗产品的生产过程中,病毒载体的包装基本都采用了贴壁的生产方式。其中,慢病毒载体贴壁生产方式存在操作复杂,可放大性低,无法全程密闭操作等弊端。为了降低生产过程的复杂程度,提高产品微生物污染的可控性,降低生产成本,科学家们经过多年的研究,开发出了慢病毒载体大规模无血清悬浮包装系统。该系统的优势在于包装用293T细胞可以达到很高的培养密度,有利于获得更多的培养基质;转染后可执行批式培养或灌流培养,有利于维持细胞活率,收获更多病毒载体;减少了血清的使用,有利于提高质粒共转染的效率,降低下游处理难度;采用一次性全密闭系统进行操作,有效提高操作效率,降低人员操作带来的污染风险(Bauleret al., 2020)。


       虽然稳定表达的逆转录病毒载体包装系统具有一定优势,但是与慢病毒载体包装系统相比,其在细胞培养方式上的差异也相对明显。逆转录病毒载体目前尚不具备商业化的大规模无血清悬浮包装系统,一般采用细胞工厂贴壁包装的方式进行逆转录病毒载体制备。这种方式存在放大困难,无法全面密闭操作,不利于控制微生物污染等问题。为了解决这些问题,Karim Ghani等人开发了基于悬浮细胞和无血清培养的工艺(Ghaniet al.,2009)。该工艺开发了基于293GP细胞的两种稳定表达细胞系。通过在悬浮体系中的培养,上述两种细胞株可以稳定表达病毒载体滴度在1×106IVP/ml以上的GALV和RD114包膜的病毒载体。


       虽然相比于贴壁表达系统或者慢病毒载体大规模无血清悬浮包装系统,逆转录病毒载体稳定表达无血清悬浮包装系统的包装效率还略逊分毫,但是,相信在不久的将来,随着越来越多的资源投入到研发过程中后,也可以看到逆转录病毒载体出现商用化的稳定表达无血清悬浮包装系统。


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结语

       细胞治疗产品生产过程中所用的病毒载体对于细胞治疗产品的商业化开发非常重要。病毒载体的选择需要研究者结合自身产品的特点和病毒载体常规制备工艺的差异谨慎决定。其中,病毒载体在工艺上的差异需要引起足够重视。当病毒载体目的基因确定后,生产成本和病毒载体产量之间的关系就需要结合生产工艺进行充分考虑。目前来看,慢病毒载体大规模无血清悬浮生产工艺的总体生产成本要优于逆转录病毒载体贴壁稳定表达生产工艺,随着技术的进一步发展,逆转录病毒载体稳定表达无血清悬浮包装系统的优势将会逐渐明显。


Reference

1. Bauler, M., Roberts, J. K., Wu, C. C., Fan, B., Ferrara, F., Yip, B. H., Diao, S., Kim, Y. I., Moore, J., Zhou, S., Wielgosz, M. M., Ryu, B., & Throm, R. E. (2020). Production of Lentiviral Vectors Using Suspension Cells Grown in Serum-free Media. Molecular Therapy - Methods and Clinical Development, 17(June), 58–68. https://doi.org/10.1016/j.omtm.2019.11.011


2. Ghani, K., Wang, X., De Campos-Lima, P. O., Olszewska, M., Kamen, A., Rivière, I., & Caruso, M. (2009). Efficient human hematopoietic cell transduction using RD114- and GALV-pseudotyped retroviral vectors produced in suspension and serum-free media. Human Gene Therapy, 20(9), 966–974. https://doi.org/10.1089/hum.2009.001


3. Park, J., Inwood, S., Kruthiventi, S., Jenkins, J., Shiloach, J., & Betenbaugh, M. (2018). Progressing from transient to stable packaging cell lines for continuous production of lentiviral and gammaretroviral vectors. Current Opinion in Chemical Engineering, 22, 128–137. https://doi.org/10.1016/j.coche.2018.09.007


4. Schweizer, M., & Merten, O.-W. (2010). Large-Scale Production Means for the Manufacturing of Lentiviral Vectors. Current Gene Therapy, 10(6), 474–486. https://doi.org/10.2174/156652310793797748


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